被認(rèn)為方案是顯而易見(jiàn)在答復(fù)工作中算是“家常便飯”。

話不多說(shuō)，我們直接上實(shí)例。

本發(fā)明公開(kāi)了一種用于肺癌和結(jié)直腸癌基因檢測(cè)的石蠟包埋參考品的制備工藝及其應(yīng)用。

本發(fā)明原權(quán)利要求撰寫(xiě)如下：

一種用于肺癌和結(jié)直腸癌基因檢測(cè)領(lǐng)域的石蠟包埋參考品的制備工藝，其特征在于，包括以下步驟：

A、已知突變基因，突變位點(diǎn)和等位基因突變頻率的細(xì)胞系的獲得；

B、肺癌和結(jié)直腸癌多基因FFPE參考品的設(shè)計(jì)；

C、細(xì)胞的培養(yǎng)與收集；

D、細(xì)胞的固定與脫水；

E、細(xì)胞的包埋與切片；

F、FFPE切片的HE染色，核酸提取與突變頻率或拷貝數(shù)的確認(rèn)。

一通審查審查意見(jiàn)指出，對(duì)比文件1公開(kāi)了與肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌等有關(guān)的基因突變檢測(cè)的FFPE質(zhì)控品的制備方法，包括已知突變基因、突變位點(diǎn)和等位基因突變頻率的細(xì)胞系的獲得、設(shè)計(jì)參考品所要檢測(cè)的目標(biāo)基因和突變類型、細(xì)胞培養(yǎng)與收集、細(xì)胞混合和固定、細(xì)胞包埋與切片、FFPE切片和DNA提取和突變頻率的確認(rèn)。

相對(duì)于對(duì)比文件1，權(quán)利要求1區(qū)別技術(shù)特征被認(rèn)定為：（1）增加脫水步驟；（2）增加F步驟。

本發(fā)明實(shí)際解決的技術(shù)問(wèn)題認(rèn)定為：如何獲得均勻性和穩(wěn)定性好的石蠟包埋參考品。

區(qū)別技術(shù)特征（1）被認(rèn)定為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)手段。

對(duì)于區(qū)別技術(shù)特征（2），對(duì)比文件2公開(kāi)了理想的室間評(píng)價(jià)樣品需要具備均勻性好的特點(diǎn)。由此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在對(duì)比文件1的基礎(chǔ)上容易想到增加F步驟，篩選均勻度好的參考品。

結(jié)論是，對(duì)比文件1結(jié)合對(duì)比文件2以后，權(quán)利要求1的技術(shù)方案被認(rèn)為是顯而易見(jiàn)的，瓦解了權(quán)利要求1的創(chuàng)造性。

看到這，作者很佩服嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶彶楣ぷ?，?duì)比文件找的妙，顯而易見(jiàn)的陳述也很贊。

接下來(lái)作者就針對(duì)本發(fā)明全文，掃雷般的找區(qū)別：

對(duì)權(quán)利要求進(jìn)行修改：

根據(jù)所找的區(qū)別技術(shù)特征對(duì)權(quán)利要求做進(jìn)一步的修改，修改為：

一種用于肺癌和結(jié)直腸癌基因檢測(cè)領(lǐng)域的石蠟包埋參考品的制備工藝，其特征在 于，包括以下步驟：

A、已知突變基因，突變位點(diǎn)和等位基因突變頻率的細(xì)胞系的獲得；

B、肺癌和結(jié)直腸癌多基因FFPE參考品的設(shè)計(jì)；

C、細(xì)胞的培養(yǎng)與收集；

D、細(xì)胞的固定與脫水；

E、細(xì)胞的包埋與切片；

F、FFPE切片的HE染色，核酸提取與突變頻率或拷貝數(shù)的確認(rèn)；

所述的各細(xì)胞系基因位點(diǎn)等位基因突變頻率AF（%）、COSMIC ID 和細(xì)胞數(shù)量確定為：

所述的細(xì)胞培養(yǎng)采用IMDM培養(yǎng)基+10％血清(+1％雙抗)培養(yǎng)體系。

所述的固定采用終濃度為8%的PFA溶液對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行固定，將固定好的細(xì)胞懸液與等體積的1％的瓊脂糖溶液混合再次固定10min-30min。

也就是，把上述表格中的區(qū)別技術(shù)特征（1）-（5）并入了權(quán)利要求1中。

根據(jù)本發(fā)明證明的技術(shù)效果，權(quán)利要求1實(shí)際解決的技術(shù)問(wèn)題是：提供了一種性能穩(wěn)定、突變頻率高、細(xì)胞包埋均一性好的肺癌和結(jié)腸癌基因檢測(cè)領(lǐng)域的石蠟切片參考品的制備方法。

本發(fā)明的答復(fù)重點(diǎn)來(lái)了，雖然相對(duì)于對(duì)比文件1有眾多的區(qū)別技術(shù)特征，但是如何說(shuō)服審查員，這些區(qū)別技術(shù)特征和所帶來(lái)的技術(shù)效果并不是顯而易見(jiàn)的。

說(shuō)理很重要，列證據(jù)擺事實(shí)更重要。

01

對(duì)比文件2沒(méi)有給出技術(shù)啟示

對(duì)比文件2公開(kāi)的是：EQA樣本應(yīng)該具有良好的均勻性。

對(duì)于區(qū)別特征（1）-（5），對(duì)比文件2都沒(méi)有給出技術(shù)啟示。區(qū)別特征（1）-（5）均為本發(fā)明與對(duì)比文件1的技術(shù)區(qū)別，而對(duì)比文件2為本發(fā)明所想要達(dá)到的技術(shù)效果。

無(wú)疑問(wèn)，本領(lǐng)域在制備石蠟切片參考品時(shí)需要做到保持良好的均一性，但是本發(fā)明中所涉及的混合細(xì)胞的組成首先是本領(lǐng)域沒(méi)有公開(kāi)過(guò)的。

因此，在特定細(xì)胞組成下，想要達(dá)到具有一定均勻性的效果，對(duì)于整個(gè)制備的技術(shù)流程都是要有要求的，并不是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道要達(dá)到均一性，就能夠確定何種處理方式能夠達(dá)到的，不同細(xì)胞的生長(zhǎng)能力、條件耐受程度、后期固定效果等等都是不一樣的。

因此想要達(dá)到均一性的結(jié)果，并不是僅能靠有同樣的目的就能完成的。

因此，對(duì)比文件2沒(méi)有給出技術(shù)啟示。

02

對(duì)比文件3沒(méi)有給出技術(shù)啟示

對(duì)比文件3公開(kāi)的是：采用4%的多聚甲醛對(duì)新鮮的細(xì)胞懸液進(jìn)行固定。

對(duì)于區(qū)別特征（1）、（2）、（3）、（5），對(duì)比文件3不涉及相關(guān)內(nèi)容，因此不能給出技術(shù)啟示。

對(duì)于區(qū)別特征（4），本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的是固定液是多種多樣的，不同的組織細(xì)胞需要不同的固定液，不同的研究目的也需要不同的固定液，并且固定液的濃度也是不確定的，同一種固定液不同的濃度固定效果也不同，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)不能通過(guò)4%的多聚甲醛直接得到本發(fā)明的8%的多聚甲醛。

以上只是在理論上進(jìn)行了闡述，空口白牙的基礎(chǔ)上還需要羅列事實(shí)證據(jù)，如現(xiàn)有技術(shù)中不同濃度多聚甲醛對(duì)細(xì)胞固定的影響，（文章、專利、刊物、書(shū)籍等，此處省略500字）。

以上現(xiàn)有技術(shù)說(shuō)明不同濃度的多聚甲醛對(duì)同種組織細(xì)胞固定效果的影響差異很大，本領(lǐng)域的技術(shù)人員無(wú)法通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)獲得本發(fā)明的細(xì)胞固定液濃度。

因此，對(duì)比文件3沒(méi)有給出技術(shù)啟示。

03

公知常識(shí)沒(méi)有給出技術(shù)啟示 

▼ 對(duì)于區(qū)別特征（1）-（2），本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的是，為了實(shí)現(xiàn)肺癌和結(jié)腸癌基因檢測(cè)，可以對(duì)相關(guān)細(xì)胞系進(jìn)行篩選。

但是發(fā)明人想要說(shuō)明的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員在篩選時(shí)面對(duì)的范圍是非常大的，一是細(xì)胞系數(shù)量，二是細(xì)胞系類型組成，再有細(xì)胞系的突變位點(diǎn)突變頻率等，同時(shí)滿足并得到本發(fā)明的細(xì)胞系，其篩選范圍是以上所有范圍相乘的結(jié)果，這顯然不是本領(lǐng)域技術(shù)人員在有限次范圍內(nèi)能夠完成的。

▼ 對(duì)于區(qū)別特征（3），本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的是：不同的培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞的活化、生長(zhǎng)、增殖等影響很大。

空口白牙的基礎(chǔ)上又羅列事實(shí)證據(jù)，如現(xiàn)有技術(shù)中存在大量對(duì)于不同培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞影響的研究，（文章、專利、刊物、書(shū)籍等，此處省略1000字）。

以上現(xiàn)有技術(shù)表明，不同的培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞的影響不同，不同的研究目的對(duì)培養(yǎng)基的要求也不同，本發(fā)明的目的在于培養(yǎng)多種不同細(xì)胞系混合的細(xì)胞產(chǎn)品，由于最終需要保持最初計(jì)算的細(xì)胞比例，因此，需要選擇特定的培養(yǎng)基維持各不同細(xì)胞系之間的生長(zhǎng)性能，避免出現(xiàn)培養(yǎng)過(guò)程中帶來(lái)的比例變化差異，在本領(lǐng)域的現(xiàn)有常識(shí)中，沒(méi)有任何一種確定的培養(yǎng)基能夠做到對(duì)所有混合細(xì)胞系的培養(yǎng)能力保持一致，因此對(duì)于本發(fā)明中特定的細(xì)胞系，本領(lǐng)域技術(shù)人員需要不斷進(jìn)行篩選，而本領(lǐng)域中培養(yǎng)基類型眾多，窮盡式篩選是不可能完成的，所以本領(lǐng)域的技術(shù)人員無(wú)法通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)得到本發(fā)明的具體培養(yǎng)基。

▼ 對(duì)于區(qū)別特征（4），本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的是：對(duì)于石蠟切片而言，組織的固定是組織隨后脫水、透明、浸蠟等處理的第一步，固定劑的作用表現(xiàn)在對(duì)材料體積的改變、硬化的程度、穿透的速度以及對(duì)染色的影響等方面。這些作用的好壞、大小，都依所固定的材料性質(zhì)而定，同樣一種固定液對(duì)某一材料來(lái)說(shuō)是良好的，但對(duì)另外一些組織可能就不很適用。所以不同的固定液對(duì)樣本的固定效果是不一樣的，從而影響后邊的脫水、透明、浸蠟等，進(jìn)而影響石蠟切片參考品的品質(zhì)。

空口白牙的基礎(chǔ)上又又羅列事實(shí)證據(jù)，如現(xiàn)有技術(shù)中存在大量對(duì)于不同固定液對(duì)石蠟切片影響的研究，（文章、專利、刊物、書(shū)籍等，此處省略700字）。

通過(guò)以上的現(xiàn)有技術(shù)可以得出，固定液是多種多樣的，不同的組織細(xì)胞需要不同的固定液，不同的研究目的也需要不同的固定液，并且固定液的濃度也是不確定的，不同的固定液固定效果不同，同一種固定液不同的濃度固定效果也不同，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)不能通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)直接得到本發(fā)明中使用的固定液及其濃度。

▼ 對(duì)于區(qū)別特征（5），石蠟包埋的脫水方式在本領(lǐng)域中并沒(méi)有唯一指向性，現(xiàn)有技術(shù)中單說(shuō)脫水劑就有兩類：一類是非石蠟溶劑，如乙醇、丙酮等，脫水后必須再經(jīng)過(guò)透明，才能透蠟包埋。另一類是兼石蠟溶劑，如正丁醇，脫水后即可直接透蠟。不同的脫水方式在環(huán)環(huán)相扣，互相影響的整個(gè)技術(shù)方案中產(chǎn)生的技術(shù)效果是不同的?？湛诎籽赖幕A(chǔ)上羅列事實(shí)證據(jù)，如現(xiàn)有技術(shù)中存在大量對(duì)于不同脫水方式對(duì)石蠟切片影響的研究，（文章、專利、刊物、書(shū)籍等，此處省略900字）。

以上現(xiàn)有技術(shù)表明石蠟切片制作的每個(gè)步驟都將影響成片效果，制片中的每一環(huán)都不可能通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行拼湊，是需要通過(guò)本領(lǐng)域的技術(shù)人員在具體的實(shí)驗(yàn)背景下，通過(guò)不斷地嘗試得到最優(yōu)解。

所以本領(lǐng)域的技術(shù)人員無(wú)法通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)直接得到本發(fā)明的脫水方式，并且保證該脫水方式對(duì)最終成片產(chǎn)生有益效果。

最后需要說(shuō)明的是，本發(fā)明的技術(shù)方案是作為一個(gè)整體發(fā)揮作用，需要整體地來(lái)分析區(qū)別技術(shù)特征所帶來(lái)的技術(shù)效果，并以此為基礎(chǔ)來(lái)確定發(fā)明實(shí)際解決的技術(shù)問(wèn)題，而不能割裂了各技術(shù)特征之間的關(guān)聯(lián)性。

對(duì)于不同細(xì)胞系的組成來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)基類型、固定方法、脫水方法等，都具有無(wú)限種可能性，而哪種方式的組合能帶來(lái)本發(fā)明類似的技術(shù)效果是不能被確定的，任何一個(gè)環(huán)節(jié)的更改，都可能導(dǎo)致本發(fā)明特定細(xì)胞系的均勻度與預(yù)期不一致的情況。本領(lǐng)域技術(shù)人員首先無(wú)法確定本發(fā)明的細(xì)胞系組成和配比，其次針對(duì)特定細(xì)胞系時(shí)，進(jìn)行篩選的條件是無(wú)限多的，組合篩選具有成千上萬(wàn)種可能，考慮到前述不同細(xì)胞之間共同培養(yǎng)的效果差異，難以確定所有的培養(yǎng)方式都能夠使最終的切片達(dá)到均一的效果。

如果基于一個(gè)或幾個(gè)區(qū)別技術(shù)特征就認(rèn)定產(chǎn)生一個(gè)實(shí)際解決的技術(shù)問(wèn)題，那么無(wú)異于割裂技術(shù)方案各技術(shù)特征之間的關(guān)聯(lián)性，從而低估了本發(fā)明技術(shù)方案的創(chuàng)造性，也是與創(chuàng)造性審查原則相違背。

到此創(chuàng)造性問(wèn)題才結(jié)束。

本發(fā)明制備工藝中的每一個(gè)區(qū)別技術(shù)特征單獨(dú)拿出來(lái)相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)都有常規(guī)篩選的嫌疑。此時(shí)，我們就需要大量的事實(shí)證據(jù)去說(shuō)明每個(gè)區(qū)別技術(shù)特征的細(xì)微變化針對(duì)不同的對(duì)象都會(huì)帶來(lái)非常大的影響，因此對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)現(xiàn)有技術(shù)是不能直接挪用的，并且對(duì)于本發(fā)明的多個(gè)區(qū)別技術(shù)特征作為一整體起作用，更是本領(lǐng)域的技術(shù)人員無(wú)法通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)獲得的，所產(chǎn)生的技術(shù)效果也是無(wú)法預(yù)料的。

總 結(jié)

在創(chuàng)造性答復(fù)中，區(qū)別技術(shù)特征作為一個(gè)客觀存在的事實(shí)是比較容易找到的，技術(shù)效果也可以直接或者補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)去對(duì)比。

區(qū)別技術(shù)特征加技術(shù)效果就可以確定實(shí)際解決的技術(shù)問(wèn)題，難點(diǎn)就是在于非顯而易見(jiàn)性，尤其是看起來(lái)常規(guī)實(shí)則通過(guò)檢索現(xiàn)有技術(shù)能夠證明區(qū)別技術(shù)特征對(duì)效果影響的不確定性，這就需要羅列大量的事實(shí)證據(jù)去力證非顯而易見(jiàn)。

對(duì)于多個(gè)區(qū)別技術(shù)特征整體起作用的，還要強(qiáng)調(diào)整體的作用，從而進(jìn)一步升華非顯而易見(jiàn)性。

述事實(shí)、講道理、擺證據(jù)，鏗鏘有力拿通關(guān)！